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細(xì)胞表面抗原染色
發(fā)布時(shí)間： 2020-09-22
細(xì)胞表面分子流式檢測(cè)步驟說明注意事項(xiàng)
1． 在使用抗體之前，快速甩動(dòng)一下，使之聚集到管的底部；
2． 熒光標(biāo)記的抗體應(yīng)該避光保存在4℃，不要冷凍；
3． 當(dāng)染色的時(shí)候，固定或延遲分析可能降低某些抗體的熒光信號(hào)。為了得到更好的結(jié)果，染色后應(yīng)該馬上分析。
過程概述：
1． 制作外周血、淋巴組織或者培養(yǎng)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液；
2． 細(xì)胞染色抗體（包括直接標(biāo)記抗體和間接標(biāo)記抗體）；
3． 洗滌步驟棄掉所有的為束縛的試劑
4． 運(yùn)行分析流式儀。
注意：流式細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)中，所有實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化都很重要。關(guān)鍵參數(shù)包括靶細(xì)胞、抗體效價(jià)以及動(dòng)力學(xué)。
試驗(yàn)A：小鼠淋巴細(xì)胞懸液的免疫熒光染色
材料：12×75 mm的圓底試管（Falcon Cat.No.2008）或96孔圓底微量滴定板（Falcon Cat.No.3910），原始抗體（既未純化也未偶聯(lián)），
緩沖液： eBioscience流式染色緩沖液（Cat.No.00-4222），流式鞘液
儀器：移液管和移液器，離心機(jī)，冰柜或冰箱，流式儀
試驗(yàn)時(shí)間
半個(gè)小時(shí)細(xì)胞準(zhǔn)備，半個(gè)小時(shí)抗體稀釋和樣品準(zhǔn)備，半個(gè)小時(shí)到一個(gè)小時(shí)孵育過程，半個(gè)小時(shí)以上的運(yùn)行和分析時(shí)間
方法細(xì)胞準(zhǔn)備：
1． 采集組織（脾，淋巴結(jié)，胸腺），用注射器的活塞擠壓以制成單細(xì)胞懸液，此過程用10ml的染色緩沖液；
2． 轉(zhuǎn)移到50ml的圓錐形試管中并使大塊沉淀到試管底部或者通過尼龍濾網(wǎng)過濾，得到單細(xì)胞懸液；
3． 4℃ 離心沉淀細(xì)胞懸液4-5分鐘（300-400g），棄掉上清；
4． 如果上過程采集的脾，還用用RBC裂解，否則進(jìn)入下一步；
5． 用50ml染色液重懸樣本，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力分析；
6． 再次離心細(xì)胞，棄掉上清，重懸細(xì)胞使其細(xì)胞數(shù)達(dá)到2×107 個(gè)/ml；
