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絮狀支原體（Mycoplasma Flocculare）和豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae）都是存在于豬呼吸道的傳染性細(xì)菌，根據(jù)抗原組合物和基因組分析判斷，這兩種支原體親緣關(guān)系較近。豬肺炎支原體是豬的地方性肺炎的病原體，而絮狀支原體一般是非致病性的，可能在豬肺炎支原體侵襲機(jī)體時造成機(jī)會感染。這兩種支原體有著與大多數(shù)支原體不同的特征，即很難培養(yǎng)和在固體培養(yǎng)基上的菌落外觀不是典型的“煎蛋”樣子。絮狀支原體大小和形狀不是固定不變的，特別是在生長后期。在生長穩(wěn)定和趨向下降階段，可發(fā)現(xiàn)細(xì)絲狀細(xì)胞，這種細(xì)胞形狀在豬肺炎支原體中不存在。

由于絮狀支原體不引起疾病，雖然在豬群中分布廣泛，但檢測方法很少，主要還是體外培養(yǎng)法，耗時較長。使用PCR法可以對絮狀支原體進(jìn)行檢測，靈敏度高，且檢測時間短，僅需幾個小時即可獲得結(jié)果。

絮狀支原體PCR檢測試劑盒選取了16S rRNA基因的一段序列進(jìn)行PCR鑒定，引物經(jīng)BLAST驗證為特異性靶向絮狀支原體，與其他生物的基因組無交叉反應(yīng)。使用本試劑盒檢測了絮狀支原體、豬肺炎支原體、豬滑液支原體（Mycoplasma Hyosynoviae）和豬鼻支原體（Mycoplasma Hyorhinis）等共19個菌株和分離株，只有絮狀支原體產(chǎn)生特異性擴(kuò)增條帶?？梢姳驹噭┖芯哂形锓N特異性，可用于絮狀支原體的鑒定和檢測。

絮狀支原體PCR檢測試劑盒【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1 樣本前處理

組織：取50mg左右組織用玻璃勻漿器勻漿，勻漿后置入潔凈的1.5ml離心管中；
液體標(biāo)本：取適量標(biāo)本13000rpm離心2min，棄上清。
1.2 DNA提取

1) 對上述處理好的標(biāo)本加入40ul 核酸提取液，100℃恒溫處理10分鐘，13,000 rpm離心5分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml EP管，-20℃保存；
2. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)代檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N（N=樣本數(shù)+1

管陰性對照+1管陽性對照），體系配制如下表：

試劑

WSSV 反應(yīng)液

酶液

用量（樣本數(shù)為N）

20μl

1μl

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟1提取的DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取4μl，加入相應(yīng)的

反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4. PCR擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀反應(yīng)槽內(nèi)；

5. 結(jié)果分析判定

絮狀支原體PCR檢測試劑盒結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置基線（baseline）：一般情況下，對ABI 7500、7700等儀器設(shè)為6-15cycle，對PE5700設(shè)為3-15cycle,對MJ Research Option2設(shè)為6-12cycle。特殊情況可對基線適當(dāng)調(diào)整。
設(shè)置閾值（threshold）:以閾值線剛超過陰性對照擴(kuò)增曲線（無規(guī)則的噪音線）的zui高點。
結(jié)果判斷
陽性：檢測樣本Ct值小于等于35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長期；
可疑：檢測樣本Ct值大于35.0且小于40.0，重復(fù)一次實驗，如果Ct值仍小于40.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長期，為陽性，否則為陰性；
陰性：檢測不到樣本Ct值或Ct值為40。

試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進(jìn)行處理。.